Aeromonas hydrophila jest istotną bakterią chorobotwórczą w akwakulturze, powodującą poważne choroby u zwierząt hodowlanych i powodujące znaczne straty ekonomiczne. Aby umożliwić szybkie wykrywanie-na miejscu, opracowaliśmy przenośną platformę mikroprzepływową, która integruje wielo-izotermiczną amplifikację izotermiczną (MIRA) z automatyczną obsługą płynów. Konstrukcja chipa obejmowała miniaturowy silnik wibracyjny i ceramiczne podkładki grzewcze w celu konserwacji
precyzyjną kontrolę temperatury i zapewniają jednorodność reakcji podczas ekstrakcji i amplifikacji kwasów nukleinowych. Miniaturowa pompa powietrzna przeprowadziła surowy ekstrakt DNA przez chip w jednym etapie pipetowania, aby zapewnić dokładnośćujęcie ilościowe. Wyekstrahowany DNA następnie przeniesiono do komory reakcyjnej wstępnie wypełnionej MIRAodczynniki do amplifikacji izotermicznej w temperaturze 39 stopni z monitorowaniem fluorescencji w czasie rzeczywistym-. Wykryto tę platformę
A. hydrophila w próbkach wody w ciągu 40 min, osiągając liniowy zakres od 1 × 10² do 1 × 10⁷ CFU⋅mL−1i granica wykrywalności (LOD) wynosząca 10 CFU⋅mL−1. Warto zauważyć, że jego modułowa konstrukcja umożliwia łatwą wymianę starterów i sond, dzięki czemu platformę można łatwo dostosować do wykrywania różnorodnych patogenów bakteryjnych w akwakulturze.
Schematyczne porównanie przenośnej platformy mikroprzepływowej i konwencjonalnej platformy do wykrywania A. hydrophila. (A) Przenośny mikroprzepływ
platforma. Proces wykrywania na tej platformie obejmuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, precyzyjne pipetowanie, amplifikację i wykrywanie. (B) Konwencjonalna platforma detekcji. Konwencjonalny przepływ pracy w laboratorium- opiera się na zaawansowanym sprzęcie, przeszkolonym personelu i czasochłonnych-procedurach.
Ocena stabilności przenośnej platformy mikroprzepływowej. (A) Zdjęcie przenośnej platformy mikroprzepływowej. (B, C) Wydajność termiczna komór do ekstrakcji i wykrywania kwasów nukleinowych. Zależność pomiędzy ceramiczną poduszką grzejną a temperaturą komory. (D) Stabilność detekcji fluorescencji (N=3). Intensywność fluorescencji mierzono w 5-minutowych odstępach podczas całego procesu amplifikacji.
Ocena wydajności przenośnej platformy mikroprzepływowej. (A) Krzywa kalibracji do wykrywania A. hydrophila (N=3). Krzywą kalibracji wyznaczono poprzez wykrycie A. hydrophila w zakresie stężeń 1 × 101 –1 × 108 CFU⋅mL−1w optymalnych warunkach. (B) Ocena powtarzalności chipa-na-chip. Test MIRA dla A. hydrophila przeprowadzono na dziesięciu chipach wytworzonych z każdej z dwóch niezależnych form. (C) Analiza specyficzności (N=3). Swoistość testu MIRA została potwierdzona w stosunku do docelowego A. hydrophila i 11 nie{10}}gatunków bakterii docelowych. (D) Porównanie z qPCR (N=3). Do wykrywania A. hydrophila w różnych stężeniach wykorzystano platformę i qPCR. (E) Wykrywanie-izolowanych w terenie szczepów (N=3). Przy użyciu platformy i metody qPCR wykryto cztery-wyizolowane terenowo szczepy A. hydrophila.