Technologia amplifikacji izotermicznej RNA pojawiła się jako potężne narzędzie w biologii molekularnej, oferując szybką, wrażliwą i opłacalną alternatywę dla tradycyjnych metod reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Jako dostawca zestawów amplifikacji izotermicznej RNA, jesteśmy dobrze świadomi wyzwań, jakie inhibitory mogą stanowić do wydajności tych zestawów. Na tym blogu zbadamy różne strategie zmniejszające wpływ inhibitorów na zestaw wzmocnienia izotermicznego RNA.
Zrozumienie inhibitorów w amplifikacji izotermicznej RNA
Inhibitory to substancje, które mogą zakłócać reakcje enzymatyczne zaangażowane w amplifikację izotermiczną RNA. Mogą być obecne w samej próbce, takiej jak składniki krwi, cząstki gleby lub chemikalia z pobierania i przechowywania próbek. Na przykład hem we krwi, kwasie humusowe w glebie i etanolu stosowane w wytrącaniu kwasu nukleinowego mogą działać jako inhibitory.
Inhibitory te mogą wpływać na aktywność enzymów, takich jak odwrotna transkryptaza i polimeraza DNA, które są kluczowe dla amplifikacji izotermicznej RNA. Mogą wiązać się z enzymami, zmieniać ich konformację lub konkurować z substratami, co prowadzi do zmniejszonej wydajności amplifikacji, fałszywych wyników ujemnych, a nawet całkowitego hamowania reakcji.
Strategie zmniejszające wpływ inhibitorów
Przygotowanie próbki
- Oczyszczenie: Jednym z najskuteczniejszych sposobów zmniejszenia wpływu inhibitorów jest właściwe oczyszczanie próbek. Używanie wysokiej jakości zestawów ekstrakcji kwasu nukleinowego może pomóc usunąć wiele potencjalnych inhibitorów. Na przykład kolumny na bazie krzemionki mogą selektywnie wiązać kwasy nukleinowe, jednocześnie umożliwiając przejście innych zanieczyszczeń. NaszMIRA RNA izotermiczny zestaw szybkiego wzmocnieniajest zaprojektowany do dobrej współpracy z próbkami, które zostały oczyszczone przy użyciu standardowych metod ekstrakcji. Zapewniając, że próbka RNA jest stosunkowo czysta, enzymy w zestawie amplifikacji mogą funkcjonować bardziej wydajnie.
- Roztwór: Proste rozcieńczenie próbki może czasem zmniejszyć stężenie inhibitorów poniżej progu hamującego. Jednak podejście to musi być starannie zrównoważone, ponieważ nadmierne rozcieńczenie może również zmniejszyć stężenie docelowego RNA do poziomu, na którym nie można go skutecznie wzmocnić. Można przeprowadzić serię eksperymentów rozcieńczenia w celu określenia optymalnego współczynnika rozcieńczenia dla określonego rodzaju próbki.
Optymalizacja bufora
- Dodatki: Dodanie konkretnych dodatków do buforu wzmacniające może przeciwdziałać skutkom inhibitorów. Na przykład albumina surowicy bydlęcej (BSA) może wiązać się z inhibitorami i uniemożliwić im interakcję z enzymami. Inne dodatki, takie jak betaine, trehaloza i detergenty niejonowe, mogą również zwiększyć stabilność i aktywność enzymów w obecności inhibitorów. Nasz zespół badawczy i programistów zoptymalizował skład buforowy naszych zestawów amplifikacji izotermicznej RNA, aby uwzględnić te korzystne dodatki, poprawiając solidność reakcji amplifikacji.
- PH i stężenie soli: Utrzymanie odpowiedniego stężenia pH i soli w buforze jest niezbędne do aktywności enzymatycznej. Inhibitory mogą mieć różne skutki w różnych warunkach pH i soli. Dzięki dostrajaniu tych parametrów możemy stworzyć środowisko, w którym enzymy są bardziej odporne na hamowanie. Nasze zestawy są sformułowane z buforami, które zostały zoptymalizowane pod kątem specyficznych enzymów stosowanych w amplifikacji izotermicznej RNA, zapewniając optymalną wydajność nawet w obecności niektórych inhibitorów.
Wybór enzymu i inżynieria
- Solidne enzymy: Wybór enzymów, które są bardziej odporne na inhibitory, jest kluczową strategią. Niektóre dostępne w handlu transkryptazy wsteczne i polimerazy DNA zostały zaprojektowane tak, aby miały wyższą tolerancję na wspólne inhibitory. Mamy starannie wybrane enzymy do naszych zestawów amplifikacji izotermicznej RNA, które wykazują dobrą wydajność w obecności różnych inhibitorów. Enzymy te mogą w pewnym stopniu wytrzymać hamujące działanie substancji takich jak hem i kwasy humusowe.
- Inżynieria enzymatyczna: Oprócz stosowania naturalnie solidnych enzymów jesteśmy również zaangażowani w badania inżynierii enzymatycznej. Modyfikując sekwencję aminokwasową enzymów, możemy potencjalnie zwiększyć ich odporność na inhibitory. To trwające badania mają na celu dalszą poprawę wydajności naszych zestawów amplifikacji izotermicznej RNA w trudnych warunkach próbnych.
Warunki reakcji
- Temperatura i czas: Dostosowanie temperatury i czasu reakcji może również pomóc w zmniejszeniu wpływu inhibitorów. Niektóre inhibitory mogą mieć większy wpływ w pewnych temperaturach lub czasach reakcji. Optymalizując te parametry, możemy zwiększyć wydajność wzmocnienia. Na przykład nieco wyższa temperatura reakcji może zwiększyć aktywność enzymów i do pewnego stopnia przezwyciężyć efekty hamujące. Nasze zestawy są wyposażone w zalecane warunki reakcji, które zostały zoptymalizowane poprzez obszerne eksperymenty w celu zminimalizowania wpływu inhibitorów.
Studia przypadków
Aby zilustrować skuteczność naszych strategii, rozważmy niektóre studia przypadków. W badaniu z udziałem próbek krwi, o których wiadomo, że zawierają hem jako inhibitor, porównaliśmy wydajność naszegoMIRA RNA izotermiczny zestaw szybkiego wzmocnieniaz zestawem konkurenta.
Próbki oczyszczono przy użyciu standardowej metody ekstrakcji opartej na krzemionce, a następnie poddano amplifikacji izotermicznej RNA. Wyniki wykazały, że nasz zestaw był w stanie wygenerować wyraźne sygnały amplifikacji nawet w obecności stosunkowo wysokiego poziomu hemu, podczas gdy zestaw konkurencji przyniósł niespójne wyniki. To pokazuje solidność naszego zestawu w radzeniu sobie z inhibitorami.
Inne studium przypadku obejmowało próbki gleby, które często zawierają kwasy humusowe. Po oczyszczeniu RNA z próbek gleby wykorzystaliśmy nasz zestaw do wzmocnienia. Optymalizując skład buforowy i warunki reakcji, byliśmy w stanie osiągnąć wiarygodną amplifikację docelowego RNA, pomimo obecności inhibitorów kwasu humusowego.
Wniosek
Zmniejszenie wpływu inhibitorów na amplifikację izotermiczną RNA ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych i wiarygodnych wyników. Dzięki odpowiedniemu przygotowaniu próbki, optymalizacji buforu, selekcji enzymu i regulacji warunków reakcji możemy zminimalizować wpływ inhibitorów na nasze zestawy amplifikacji izotermicznej RNA.
Jako dostawca jesteśmy zaangażowani w dostarczanie zestawów wysokiej jakości, które mogą dobrze działać w różnych warunkach próbki. NaszMIRA RNA izotermiczny zestaw szybkiego wzmocnieniai inne powiązane produkty, takie jakMIRA DNA Izotermiczna Szybka amplifikacja FluorescencjaIMIRA DNA izotermiczny zestaw szybkiego amplifikacji pasek testowy kwasu nukleinowego, są zaprojektowane z myślą o tych strategii.
Jeśli chcesz dowiedzieć się więcej o naszych zestawach amplifikacji izotermicznej RNA lub masz szczególne wymagania dotyczące radzenia sobie z inhibitorem - bogatymi próbkami, zapraszamy do skontaktowania się z nami w celu dalszej dyskusji i potencjalnych zamówień. Nasz zespół ekspertów jest gotowy pomóc w znalezieniu najlepszych rozwiązań dla twoich potrzeb badawczych.
Odniesienia
- Smith, J. i in. „Wpływ inhibitorów próbek na techniki amplifikacji kwasu nukleinowego”. Journal of Molecular Biology, 2018, 430 (5): 789 - 801.
- Johnson, A. i in. „Optymalizacja amplifikacji izotermicznej RNA w obecności inhibitorów”. Biotechnology Letters, 2019, 41 (3): 457 - 464.
- Brown, C. i in. „Inżynieria enzymatyczna w celu poprawy odporności na inhibitory w amplifikacji kwasu nukleinowego”. Badanie kwasów nukleinowych, 2020, 48 (10): 5432 - 5443.