Polimeraza DNA jest kluczowym enzymem w biologii molekularnej, odgrywając centralną rolę w procesach replikacji i naprawy DNA. W laboratorium oczyszczanie polimerazy DNA jest procesem drobiazgowym i wielopogetapowym, który wymaga starannego planowania i wykonania. Jako dostawca polimerazy DNA, mam się dobrze w zawiłości tego procesu oczyszczania i chciałbym podzielić się z tobą szczegółami.
Początkowe kroki: wzrost komórek i liza
Pierwszy krok w oczyszczaniu polimerazy DNA często zaczyna się od rosnących komórek, które wyrażają enzym. Zwykle bakterie, takie jak Escherichia coli, są stosowane jako komórki gospodarza, ponieważ są one łatwe do hodowli, szybko rosną i mogą być genetycznie zmodyfikowane w celu nadekspresji docelowej polimerazy DNA. Bakterie są zwykle uprawiane w odpowiedniej pożywce hodowlanej w kontrolowanych warunkach temperatury, pH i napowietrzania. Na przykład E. coli jest często hodowane w 37 ° C w bogatej pożywce, takiej jak Beria - Bertani (LB).
Gdy komórki osiągną odpowiednią gęstość, są one zbierane przez wirowanie. Osad komórkowy jest następnie zawieszany w roztworze bufora. Aby uwolnić polimerazę DNA z komórek, przeprowadza się etap lizy. Istnieje kilka metod do lizy komórek, w tym metody mechaniczne (takie jak sonikacja), metody chemiczne (z wykorzystaniem detergentów takich jak Triton X - 100) i metody enzymatyczne (z wykorzystaniem lizozymu do rozbicia ściany komórkowej bakteryjnej). Sonikowanie jest popularnym wyborem, ponieważ może skutecznie zakłócać komórki bez powodowania znacznego uszkodzenia enzymu. Należy go jednak starannie kontrolować, aby uniknąć ponad - podgrzewanie próbki, która mogłaby denaturować polimerazę DNA.
Surowe przygotowanie i wyjaśnienie ekstraktu
Po lizie komórek powstała mieszanina zawiera różne składniki komórkowe, w tym białka, kwasy nukleinowe, lipidy i resztki komórkowe. Jest to znane jako surowy ekstrakt. Aby usunąć resztki dużej skali, surowy ekstrakt jest wirowany z dużą prędkością. Supernatant, który zawiera rozpuszczalne białka, w tym polimerazę DNA, jest starannie gromadzony.
Czasami surowy ekstrakt może nadal zawierać znaczną ilość kwasów nukleinowych, które mogą zakłócać kolejne etapy oczyszczania. Aby usunąć te kwasy nukleinowe, można przeprowadzić etap wytrącania przy użyciu związku polikationowego, takiego jak polietylenoimina (PEI). PEI wiąże się z ujemnie naładowanymi kwasami nukleinowymi, powodując ich wytrącanie, które można następnie usunąć przez wirowanie.
Oczyszczanie chromatograficzne
Chromatografia jest kamieniem węgielnym oczyszczania polimerazy DNA. Istnieje kilka rodzajów technik chromatograficznych, które można zastosować, każda oparta na różnych zasadach separacji.
Ion - Chromatografia Exchange
Chromatografia jonowa - wymiana jest często pierwszym krokiem chromatograficznym w procesie oczyszczania. Oddziela białka na podstawie ich ładunku netto. Polimerazy DNA mają charakterystyczny ładunek przy danym pH, co pozwala im wiązać się z dodatnio naładowaną (anion - wymiana) lub ujemnie naładowaną (kation - wymianę). Na przykład, jeśli polimeraza DNA ma netto ładunek ujemny netto przy określonym pH, można zastosować żywicę wymiany anionowej, takiej jak celuloza dietyloaminoetylowa (DEAE). Surowy ekstrakt jest ładowany na kolumnę, a polimeraza DNA wiąże się z żywicą, podczas gdy inne białka o różnych ładunkach przechodzą. Związaną polimerazę DNA można następnie elurować poprzez zwiększenie stężenia soli w buforze. Ta metoda jest skuteczna w usuwaniu wielu zanieczyszczeń i może znacznie wzbogacić polimerazę DNA w próbce.
Chromatografia powinowactwa
Chromatografia powinowactwa jest wysoce specyficzną metodą oczyszczania. Wykorzystuje specyficzną interakcję między polimerazą DNA a ligandem unieruchomionym na żywicy. Jednym z powszechnych podejść jest użycie systemu His - tag. Jeśli polimeraza DNA została genetycznie zmodyfikowana w celu zawierania znacznika histydyny (jego - tagu), można zastosować żywicę niklu - kwasu nitilotrioctowego (NI - NTA). His - znacznik wiąże się specjalnie z jonami niklu na żywicy, umożliwiając selektywne zachowanie polimerazy DNA na kolumnie. Inne białka, które nie mają jego - tag przechodzą przez kolumnę. Związaną polimerazę DNA można elurować, dodając imidazol do bufora, który konkuruje z jego - znacznikiem o wiązaniu z jonami niklu.
Innym rodzajem chromatografii powinowactwa, które można zastosować, jest chromatografia DNA - powinowactwa. Ponieważ polimeraza DNA ma naturalne powinowactwo do DNA, można zastosować żywicę zawierającą DNA. Polimeraza DNA wiąże się z DNA na żywicy, a inne białka wiążące nie wiążące DNA są usuwane. Związaną polimerazę DNA można następnie elurować, zmieniając warunki buforu, takie jak zwiększenie stężenia soli lub dodanie DNA konkurenta.
Rozmiar - chromatografia wykluczająca
Rozmiar - Chromatografia wykluczająca, znana również jako chromatografia filtracyjna żel -filtracyjna, oddziela białka na podstawie ich wielkości. Kolumna jest wypełniona porowatymi koralikami. Mniejsze białka mogą wchodzić do pory perełek i mieć dłuższą ścieżkę przez kolumnę, podczas gdy większe białka przechodzą przez przestrzenie między koralikami i elurują wcześniej. Ta metoda jest przydatna do usuwania pozostałych agregatów lub małych zanieczyszczeń cząsteczkowych. Można go również zastosować do określenia masy cząsteczkowej oczyszczonej polimerazy DNA.
Ostateczne oczyszczenie i kontrola jakości
Po etapach chromatograficznych polimeraza DNA jest zwykle wysoce oczyszczona. Jednak nadal mogą występować drobne zanieczyszczenia. Ostateczny etap polerowania, taki jak chromatografia interakcji hydrofobowej lub chromatografia fazowa odwrotnej, można przeprowadzić w celu dalszego oczyszczenia enzymu.
Po zakończeniu oczyszczania niezbędne są rygorystyczne miary kontroli jakości. Czystość polimerazy DNA można ocenić za pomocą technik takich jak elektroforeza żelowa sodu - elektroforeza żelowa poliakryloamidowa (SDS - strona). Pojedynczy pasek na żelu wskazuje na próbkę o wysokiej czystości. Aktywność polimerazy DNA można zmierzyć za pomocą testu syntezy DNA in vitro. Specyficzna aktywność, która jest ilością aktywności enzymu na jednostkę białka, jest ważnym parametrem oceny jakości oczyszczonej polimerazy DNA.
Inne powiązane enzymy i nasze portfolio produktów
Oprócz polimerazy DNA nasza firma oferuje również szereg innych enzymów wysokiej jakości do badań laboratoryjnych. Na przykład mamyBiałko GP41 2.0, który odgrywa ważną rolę w procesach replikacji DNA. Innym produktem jestEgzonukleaza III 2.0, co jest przydatne do badań naprawy i modyfikacji DNA. I naszSC RecA 2.0bierze udział w homologicznej rekombinacji i mechanizmach naprawy DNA.
Wniosek
Oczyszczanie polimerazy DNA w laboratorium jest procesem złożonym, ale satysfakcjonującym. Dzięki starannemu wzrostowi komórek, lizowaniu, oczyszczaniu chromatograficznym i kontroli jakości jesteśmy w stanie uzyskać wysoce czystą i aktywną polimerazę DNA. Jako dostawca polimerazy DNA, jesteśmy zaangażowani w zapewnianie najwyższej jakości produktów w celu zaspokojenia potrzeb społeczności naukowej. Jeśli jesteś zainteresowany naszą polimerazą DNA lub innymi produktami enzymatycznymi, zapraszamy do skontaktowania się z nami w celu uzyskania zamówień i dalszych dyskusji. Zawsze jesteśmy gotowi zaoferować profesjonalne porady i wsparcie, aby upewnić się, że masz najlepsze - odpowiednie odczynniki do projektów badawczych.
Odniesienia
- Sambrook, J., i Russell, DW (2001). Klonowanie molekularne: podręcznik laboratoryjny. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Scopes, RK (1994). Oczyszczanie białka: zasady i praktyka. Springer - Verlag.
- Deutscher, MP (1990). Przewodnik po oczyszczaniu białka. Academic Press.