Krewetki trawiaste są ważnym gatunkiem gospodarczym w chińskim przemysłu akwakultury słodkowodnej. Jednak w ostatnich latachHepatopancreatic Microsporidium(EHP), pasożyt zakażony hepatopantrasem krewetek, poważnie wpłynął na branżę. Ponieważ obecnie nie ma skutecznego leku ani szczepionki do leczenia tej choroby, szybkie i dokładne wykrywanie ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania jej rozprzestrzenianiu się.
A.Magnified 9. 0 × 1 0 3 razy; B. Powiększone 5,0 × 104 razy.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang Ge, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Izolacja i obserwacja morfologiczna mikrosporidium wątroby w litopenaeus vannamei. Journal of Fishery Sciences of China, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430.
Wykrywanie EHP zależy przede wszystkim na metodach biologii molekularnej, przy czym technologia PCR jest najczęstsza. Chociaż PCR oferuje wysoką wrażliwość, wymaga kosztownego sprzętu PCR i specjalistycznego środowiska laboratoryjnego, co czyni go nieodpowiednim do użytku w terenie. Aby rozwiązać ten problem, zespół badawczy opracował dwie metody szybkiego wykrywania oparte na technologii Mira. Metody te oferują wysoką czułość, szybką reakcję i łatwą obsługę, umożliwiając wydajne i szybkie wykrywanie EHP w krewetkach na miejscu bez potrzeby skomplikowanego sprzętu laboratoryjnego, wypełniając w ten sposób lukę w obecnych metodach wykrywania.
Odczynniki wzmocnienia zastosowane w badaniu:
- DNA izotermiczny zestaw szybkiego wzmocnienia (podstawowy)
- DNA izotermiczny zestaw szybkiego amplifikacji (koloidalny złoty pasek)
Technologia MIRA to wielo-enzymalna metoda amplifikacji szybkiego kwasu nukleinowego. Jego podstawowa zasada obejmuje skoordynowane działanie wielu funkcjonalnych białek w temperaturach otoczenia w celu osiągnięcia szybkiego amplifikacji kwasu nukleinowego, umożliwiając naprawdę przenośne wykrywanie kwasu nukleinowego na miejscu.
Metody badawcze
Ekstrakcja próbki
Zespół badawczy zebrał zarówno zarażone, jak i zdrowe próbki krewetek z trzech gospodarstw krewetkowych w prowincji Liaoning, wydobywając DNA z wątroby krewetki.
Projekt podkładu
Zaprojektowano trzy zestawy starterów mira ukierunkowanych na gen białka seryny S8 EHP (numer dostępu GenBank: w 182063 r.). Ten gen ma unikalne aktywne miejsca, zapewniając swoistość wykrywania.
Wykrywanie MIRA-AGE i MIRA-LFD
(A) Zoptymalizowane temperatury reakcji w wieku RPA. M: Marker DL 500; N: kontrola negatywna; Szczepy 1-5: 25 stopni, 30 stopni, 37 stopni, 39 stopni i 42 stopnie.
(B) Zoptymalizowane czasy reakcji w wieku RPA. M: Marker DL 500; N: kontrola negatywna; 1: 10 min; 2: 20 min; 3: 30 min; 4: 40 min.
(C) Zoptymalizowane temperatury reakcji RPA-LFD. N: kontrola negatywna; 1: 25 stopni; 2: 30 stopni; 3: 37 stopni; 4: 39 stopni; 5: 42 stopnie.
(D) Zoptymalizowane czasy reakcji RPA-LFD. N: kontrola negatywna; 1: 5 min; 2: 10 min; 3: 20 min.
Do wykrycia EHP zastosowano dwie metody wykrywania MIRA, MIRA-AGE (elektroforeza z żelem agarozowym) i MIRA-LFD (koloidalny test immunologiczny z złotego przepływu)). Zespół badawczy zoptymalizował temperatury i czasy reakcji poprzez eksperymenty. MIRA-AGE wzmocniło docelowe DNA w 30 minut przy 37 stopniach, podczas gdy mira-LFD zakończyła amplifikację w zaledwie 10 minut na 37 stopniach, a wyniki są czytelne w ciągu 5 minut.
Wyniki eksperymentalne
Specyficzność i czułość
(A) Specyficzność wykrywania w wieku RPA. M: Marker DL 1000; P: Nosema bombyciis; 1: EHP; 2: Encephalitozoon; 3: Microsporidia; 4: Wirus zespołu białego miejsca; 6: Nieprawidłowy; N: kontrola negatywna.
(B) Specyficzność wykrywania RPA-LFD. P: Nosema bombyciis; N: kontrola negatywna; 1: EHP; 2: Encephalitozoon; 3: Microsporidia; 4: Wirus zespołu białego miejsca; 6: Nieprawidłowe.
(C) Czułość AGE RPA z gradientowymi rozcieńczeniami plazmidów rekombinowanych. M: Marker DL 500; N: kontrola negatywna; 1: 4,7 × 10^5 kopii/µl; 2: 4,7 × 10^4 kopie/µl; 3: 4,7 × 10^3 kopie/µl; 4: 4,7 × 10^2 kopie/µl; 5: 4,7 kopie/µl; 6: 4,7 kopie/µl.
(D) Czułość RPA-LFD z gradientowymi rozcieńczeniami plazmidów rekombinowanych. N: kontrola negatywna; 1: 4,7 × 10^5 kopii/µl; 2: 4,7 × 10^4 kopie/µl; 3: 4,7 × 10^3 kopie/µl; 4: 4,7 × 10^2 kopie/µl; 5: 4,7 kopie/µl; i 6: 4,7 kopie/µl.
Eksperymenty wykazały, że technologia MiRA ma dużą swoistość, dokładnie wykrywając EHP bez reagowania na inne patogeny. Pod względem czułości obie metody miały granicę wykrywania 4,7 kopii/µl, znacznie wyższą niż czułość tradycyjnego PCR.
Testy próbki kliniczne
Wyniki testowania 30 próbek klinicznych wykazały, że MIRA-AGE i MiRA-LFD miały wskaźnik pozytywności wynoszący 70%, nieco niższy niż 80%QPCR, ale znacznie wyższy niż 56,7%PCR.
Perspektywy aplikacji
Metody wykrywalności oparte na MIRA pozwalają na szybkie wzmocnienie genów docelowych w stałych temperaturach. W szczególności metoda Mira-LFD może zapewnić wyniki w zaledwie 10 minut bez potrzeby skomplikowanego sprzętu laboratoryjnego, co czyni ją idealną do użytku na miejscu w gospodarstwach krewetkowych. Wysoka wrażliwość i specyficzność tej technologii sprawiają, że jest to skuteczne narzędzie do wczesnego wykrywania i kontroli EHP, chroniąc w ten sposób zdrowie i rozwój branży hodowli krewetek trawiastych.
Spośród tych metod koloidalny test immunologiczny z złotego przepływu (mira-LFD) jest szczególnie odpowiedni do zastosowań na miejscu ze względu na jego prostotę i intuicyjne wyniki. Rolnicy z krewetkami traw mogą szybko wykrywać i reagować na infekcje EHP, poprawiając zdolności kontroli choroby, znacznie zwiększając wydajność rolnictwa i zmniejszając straty ekonomiczne.