Staphylococcus haemoliticus to bakteria koagulazy-koagulazy Gram-dodatni, która jest bardzo powszechna w szpitalach. W ostatnich latach rośnie obawy ze względu na wysokie ryzyko zakażeń szpitalnych. Staphylococcus haemoliticus może dalej powodować infekcje skóry, zapalenie opon mózgowych, zapalenie otrzewnej, a nawet sepsę. Opóźnienia w diagnozie klinicznej mogą prowadzić do pogorszenia się w stanach zdrowotnych, więc szybka diagnoza Staphylococcus haemoliticus jest kluczem do precyzyjnego leczenia.
Grupa badawcza profesora Ji Tuo z Departamentu Centralnego Laboratorium Lianyungang Second People's Hospital opublikowała artykuł „szybkie i wizualne wykrywanie Staphylococcus hemolyticus w próbkach klinicznych z mira-LF” w czasopiśmie „Analytica chimica akta”, z czynnikiem wpływu 6,2.
Przegląd badania
W tym badaniu grupa Prof. Ji Tuo ustaliła metodę wykrywania Staphyloliticus haemolyticus przez mira-LF opartą na genie MVAA i zastosowała technologię szybkiego amplifikacji kwasu nukleinowego o stałej temperaturze w celu szybkiego wykrywania patogenu. Eksperyment przeprowadzono w 37 stopnie, a wyniki wykryto w ciągu 9 minut z czułość wykrywania 0. 147 CFU/reakcja. Metoda wykrywania MIRA-LFS jest odpowiednia do wykrywania punktu stałego Staphylococcus haemoliticus w próbkach klinicznych i realizuje metodę identyfikacji Staphylococcus haemolyticus przez POCT, która ma ogromną wartość dla szybkiej diagnozy i leczenia chorób w niedostatecznych obszarach. Grupa badawcza wykorzystała MIRA-LF, QPCR i tradycyjne metody hodowli bakteryjnej do analizy 95 losowych próbek klinicznych i potwierdziła kliniczne zastosowanie.
Metody badawcze
Schematyczny schemat testu Mira-LFS pokazano powyżej. W tym badaniu zastosowano zestaw do szybkiego amplifikacji DNA AMPFUTURE BIOTECH (koloidalny pasek testowy złoty) i pasek testu wykrywania kwasu nukleinowego.
Długość startera genu MVAA wynosiła nukleotydy 30-35, a długość produktu amplifikacji wynosiła 100-350 BP i zaprojektowano w sumie 6 par starterów kandydujących. GDNA standardowych szczepów gronkowców Staphylolitycznych Staphylococcus zastosowano do analizy MIRA, przesiewano kandydujące startery, a amplifikowane produkty wizualizowano przez 2% elektroforezy żelu agarozowego.
(Produkty wzmacniające są wyświetlane przy użyciu elektroforezy żelu agarozowego)
Sonda jest następnie projektowana zgodnie z sekwencją startera do przodu (16 pz wstecz). 5 'koniec sondy jest oznaczony FITC, a koniec 3' jest oznaczony C3. Nukleotyd pozycji 31- w sondzie jest zastępowany THF w odległości 30 bp od końca 5 'i 15 pz od końca 3'. Koniec 5 'wybranego podkładu odwrotnego jest oznaczony biotyną.
(Schematyczny schemat modyfikacji kombinacji starterowych i sekwencji kombinacji starterów)
Ponadto zoptymalizowano warunki reakcji do wykrywania miRA-LF przez Staphylococcus haemoliticus. Testy są wykonywane w 37 stopnie od 4-12 min w odstępach 2 minut. Wyniki pokazano w 8 -minutowym czasie reakcji, a linia testowa jest wyraźnie widoczna. Ponadto test jest wykonywany ze stopnia 22-52 w odstępach 5 stopni. 37-42 Stopień jest najbardziej odpowiednią temperaturą do wykrywania Mira-LFS. Dlatego optymalny czas reakcji i temperatura metody MIRA-LFS dla Staphylococcus haemolyticus wynosiły odpowiednio 8 minut i 37 stopni. Wraz z faktem, że końcowy wynik jest wizualizowany przez LFS w ciągu 1 minuty, całkowity czas wykrywania wynosi 9 minut.
(Optymalizacja czasu reakcji i temperatury)
Wyniki eksperymentalne
1. Weryfikacja wrażliwości
Różne stężenia genomowego DNA (GDNA) uzyskane z seryjnych rozcieńczeń kultur Staphylococcus haemolytica (1 0^6-10^0 cfu/ml) zostały przetestowane dla mira-LF.
(Sygnał dodatni w różnych stężeniach)
Analiza regresji jednostkowej probabilistycznej wykazała, że 95% LOD określony przez test mira-LFS wynosił 0. 147cfu/reakcja.
(Limit obliczania wykrywania)
2. Walidacja swoistości
Selektywność wykrywania MIRA-LF określono przez analizę 18 szczepów typowych mikroorganizmów patogennych i 15 szczepów klinicznego gronkowca hemoliticus. Wyniki wykazały, że test mira-LFS był ujemny dla wszystkich 18 innych bakterii patogennych i dodatni dla 15 zweryfikowanych próbek klinicznych Staphylococcus haemolticus.
(8 szczepów standardowych bakterii patogennych i 15 szczepów klinicznego hemolitycznego streptococcusa odpowiednio)
Test Mira-LFS ma wysoką selektywność i nadaje się do badania przesiewowego Staphylococcus haemoliticus.
3. Rzeczywiste testowanie próbki
W sumie 95 próbek losowo zebrano ze szpitala drugiego ludzi w Lianyungang, w tym 35 próbek skóry i tkanki miękkiej, 16 próbek moczu, 14 próbek plwociny i 30 próbek krwi.
(95 próbek klinicznych przetestowano różnymi metodami)
Wyniki wykazały, że metoda wykrywania była w 100% zgodna z metodą QPCR. Ponadto, w porównaniu ze złotym standardem (GB/T4789. 11-2003), czułość i swoistość testu mira-LFS do identyfikacji infekcji Staphylococcus heemolytica wynosiły odpowiednio 100% i 98,73%. Wyniki te dodatkowo potwierdzają techniczną wykonalność metody w wykrywaniu Staphylococcus haemoliticus w próbkach klinicznych.
Metoda Mira-LFS jest stosowana do szybkiego wykrywania Staphylococcus haemolyticus przez POCT, który jest wydajny, dokładny, prosty i opłacalny, co jest pomocne w szybkiej diagnozowaniu i decyzjach dotyczących leczenia.