W artykule zaproponowano nową technologię mikroprzepływową chipów do wykrywania multipleksów patogennych mikroorganizmów krewetek. Zespół badawczy zintegrował technologię izotermiczną szybkiego amplifikacji kwasu nukleinowego (MIRA) i metod wykrywania fluorescencji w czasie rzeczywistym. Ten mikroprzepływowy układ zapewnia szybkie, wrażliwe i wydajne rozwiązanie do wykrywania głównych patogenów krewetek.
Tło i znaczenie badań
Globalny przemysł hodowli krewetek jest jednym z najważniejszych elementów ekonomicznych w akwakulturze, ale branża od dawna staje w obliczu zagrożeń od różnych patogennych mikroorganizmów. Patogeny te często prowadzą do śmierci krewetek na dużą skalę, co poważnie wpływa na korzyści produkcyjne i ekonomiczne. W tym ostra choroba martwicy wątrobowej (AHPND), wirus zespołu białego punktu (WSSV), zakaźny hipodermalny i hematopoetyczny wirus martwicy (EHP), bakteria i parazites Pose do głównych zagrożeń dla branży shipp.
Tradycyjne metody wykrywania patogenów, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (technologia PCR), mają wysoką wrażliwość i swoistość, ale są złożone w obsłudze, trwa długie i polegające na sprzęcie laboratoryjnym. Ograniczenia te sprawiają, że technologia PCR nie nadaje się do szybkich testów na miejscu. Technologia MIRA stała się narzędziem wykrywania molekularnym odpowiednim do zastosowania na miejscu ze względu na jej charakterystykę szybkiego wzmocnienia w stałej temperaturze i normalnej temperaturze.
Zasada technologii Mira
Technologia amplifikacji szybkiego kwasu nukleinowego o stałej temperaturze (technologia MIRA) jest technologią amplifikacji o stałej temperaturze, która opiera się na synergii wielu funkcjonalnych białek w temperaturze pokojowej w celu szybkiego wzmocnienia kwasów nukleinowych. Jest to naprawdę przenośna technologia wykrywania szybkiego kwasu nukleinowego. W porównaniu z PCR, Mira ma więcej zalet.
Projektowanie i innowacja mikroprzepływowych układów
Schematyczny schemat platformy wykrywania RPA na chipie dla kilku ważnych mikroorganizmów patogennych krewetek
(A) Struktura mikroprzepływowego układu typu TID. 1: komora reakcyjna; 2: zawór kulowy; 3: Port wydechowy; 4: Port próbkowania;
(B) Widok eksplodowany. 5: Folia do pieczęci cieplnej; 6: Podłoże chipowe.
(C) Szczegółowy układ sześciu zestawów starterów w sektorze. Każdy zestaw starterów jest wstępnie ustawiony w wyznaczonej komorze reakcyjnej.
(D) Kompletna procedura operacyjna na chipie platforma wykrywania RPA.
W artykule proponuje układ mikroprzepływowy zintegrowany z technologią MIRA do wykrywania multipleksów patogennych mikroorganizmów krewetek. Technologia mikroprzepływowa może kontrolować ciecze w kanałach na poziomie mikronów w celu precyzyjnej manipulacji, osiągając w ten sposób wydajne i tanie wykrywanie wielu celów.
Chip ma następujące kluczowe funkcje konstrukcyjne:
● Odśrodkowy układ mikroprzepływowy
Chip przyjmuje konstrukcję napędu odśrodkowego, wykorzystując siłę odśrodkową do równomiernego rozmieszczenia próbki na każdą komorę reakcji. Ten projekt upraszcza proces działania, a operator może wypełnić całą reakcję, po prostu wstrzykiwając próbkę.
● Wykrywanie wielu celów
Chip jest wstępnie zatwierdzony typami bakterii, które należy wykryć: ostra martwica wątroby (V-AHPND), wirus zespołu białego punktu (WSSV), zakaźne wirus martwicy podskórnej (ihhnv), hemocyt z krewetek irydowirusa (SHIV) i enterohepat zapalenie (EHP). ) Sondy starterowe dla pięciu patogenów. Ten projekt może jednocześnie wykryć sześć celów genów w jednej reakcji, umożliwiając szybkie badanie wielu patogenów.
● Wykrywanie fluorescencji w czasie rzeczywistym
Reakcja amplifikacji technologii Mira w układie jest łączona z sondy fluorescencyjnej, która może monitorować postęp reakcji amplifikacji w czasie rzeczywistym. Projekt sondy umożliwia uwalnianie sygnału fluorescencyjnego tylko wtedy, gdy produkt amplifikacji jest generowany, osiągając w ten sposób szybkie i czułe wykrywanie ilościowe.
● System reakcji o niskim stężeniu
Każda jednostka reakcji układu wymaga tylko objętości reakcji 5 μl, co znacznie zmniejsza zużycie odczynnika. Kiedy cały system działa, można przetwarzać jednocześnie do czterech próbek, a każda próbka może wykryć pięć patogenów, znacznie poprawiając wydajność wykrywania.
Czułość, swoistość i powtarzalność
Wydajność systemu ChIP obejmuje wykrywanie symetrii, rezonansu i powtarzalności.
● Wrażliwość
Wyniki eksperymentalne pokazują, że CHIP może wykrywać docelowe liczby kopii genów tak niskie jak 10 kopii/μl, z wrażliwością, która jest porównywalna lub nawet wyższa niż tradycyjne metody PCR. Ta wysoka wrażliwość zapewnia, że technologia może wykryć osoby wcześnie zainfekowane w praktycznych zastosowaniach, umożliwiając w ten sposób wczesne badanie patogenów.
● Specyficzność
Eksperyment przeprowadził testy reakcji krzyżowej na różnych patogenach innych niż wyniki, a wyniki wykazały, że układ jest wysoce specyficzny dla docelowych patogenów i może dokładnie rozróżnić różne rodzaje patogenów. Wszystkie testy ostrej choroby martwicy wątrobowej (V-AHPND), wirusa zespołu białego punktu (WSSV), zakaźnego hipodermalnego i hematopoetycznych wirusa martwicy (IHHNV), krewetek hemacytycznych wirusa podaszczania (SHIV) i enteroheptatica (EHP). Wszystko wykazywało, że nie ma metody, wskazuje na to, że wskazuje na to, że wskazuje na to, że wskazuje na to, że wskazuje na to, że wskazuje na to, że wskazuje na to, że wskazuje na to, że wskazuje na to, że wskazuje na to, że to wskazuje, wskazuje na to, że to wskazuje, wskazuje, wskazuje, wskazuje na to, wskazują, wskazuje, wskazuje, wskazuje, wskazuje, wskazuje, wskazuje, wskazuje, wskazuje, wskazuje, wskazuje, wskazuje na to wskazanie, wskazuje na sposób skuteczny, wskazuje na to. Niespecyficzne wzmocnienie.
● Powtarzalność
Aby ocenić stabilność metody, zespół badawczy przeprowadził wiele powtarzających się eksperymentów. Wyniki wykazały, że współczynnik zmienności (wartość CV) między różnymi eksperymentami był mniejszy niż 10%, wykazując dobrą eksperymentalną powtarzalność i spójność.
Aplikacje i zalety terenowe
Projektowanie technologii mikroprzepływowej Mira daje mu znaczące zalety zastosowania w terenie, szczególnie odpowiednie do szybkiego wykrywania i monitorowania patogenów w hodowli krewetek:
● Wygodny proces pracy
Cały proces wykrywania wymaga jedynie wstrzykiwania próbki do układu i uruchamiania urządzenia reakcyjnego. Nie wymaga prawie żadnej ręcznej operacji i jest odpowiedni dla osób niebędących profesjonalistami na miejscu.
● Możliwość szybkiej reakcji
System może uzyskać wyniki testu w ciągu 20 minut, znacznie skracając czas testu. Ma to kluczowe znaczenie dla szybkiej reakcji choroby w gospodarstwach i zmniejszenia rozprzestrzeniania się patogenów.
● Możliwość wykrywania multipleksu
Pięć głównych patogenów można zidentyfikować w jednym teście, co znacznie poprawia wydajność wykrywania i oszczędza koszty i czas wykrywania.
Perspektywy technologii Mira
Chociaż technologia PCR od dawna jest oceniana jako złoty standard wykrywania amplifikacji kwasu nukleinowego, technologia Mira wykazała duży potencjał zastosowania ze względu na szybką reakcję przy stałej temperaturze, prostej pracy i niskich wymaganiach dotyczących sprzętu. W porównaniu z PCR w połączeniu z sekwencjonowaniem DNA, stwierdzono, że wyniki wykrywania izotermicznego układu amplifikacji są zgodne z wynikami PCR pod względem czułości i swoistości, a czas reakcji technologii MIRA jest znacznie skrócony. Dlatego mikroprzepływowe układy MIRA są uważane za technologię bardziej odpowiednią do zastosowań terenowych, szczególnie w środowiskach wymagających szybkiego i na dużą skalę wykrywania patogenów.
Technologia mikroprzepływowych układów opartych na izotermicznej amplifikacji kwasu nukleinowego (MIRA) stanowi skuteczne narzędzie do wykrywania patogennych mikroorganizmów w hodowli krewetek. Ta technologia ma zalety wysokiej czułości, dobrej specyficzności, łatwej pracy i szybkiej szybkości wykrywania oraz ma szerokie perspektywy zastosowania w zapobieganiu i kontroli chorób akwakultury. W przypadku dalszego rozwoju i optymalizacji technologii, oczekuje się, że system zostanie zastosowany do wykrywania bardziej wodnych patogenów, umożliwiając szersze zapobieganie chorobom i monitorowanie.
Wyniki badań stanowią niezawodną metodę wczesnego wykrywania dla przemysłu akwakultury, która może skutecznie zmniejszyć ryzyko wybuchów chorób, poprawić wydajność produkcji i produkcję gospodarstw oraz stanowić podstawę techniczną dla zrównoważonego rozwoju przemysłu akwakultury.