Jako dostawca detektorów fluorescencyjnych spędziłem sporo czasu na myśleniu o tajnikach tych fajnych urządzeń. Detektory fluorescencyjne są bardzo przydatne we wszystkich rodzajach dziedzin, od badań medycznych po monitorowanie środowiska. Pracują, wykrywając światło, które substancja fluorescencyjna emituje po wzbudzeniu przez określoną długość fali światła. Ale jak każdy kawałek technologii, mają swoje ograniczenia. Zanurzmy się w tym, co to są.
Wrażliwość i hałas tła
Jednym z głównych ograniczeń detektorów fluorescencyjnych jest wrażliwość. Chociaż na ogół są całkiem dobre w zbieraniu sygnałów fluorescencyjnych, istnieje ograniczenie, jak mały sygnał może wykryć. Jest to wielka sprawa, gdy pracujesz z próbkami, które mają bardzo niskie stężenie substancji fluorescencyjnej. Detektor może nie być w stanie odróżnić słabego sygnału od szumu tła.
Hałas tła to zasadniczo każde światło, które detektor wybiera, które nie jest z substancji fluorescencyjnej, którą interesuje Cię interes. Może pochodzić z grupy źródeł, takich jak rozpłuchane światło w laboratorium, autofluorescencja z macierzy próbki lub szum elektryczny w samym detektorze. Ten szum może sprawić, że naprawdę trudno jest dokładnie zmierzyć sygnał fluorescencji, szczególnie gdy jest słaby.
Na przykład w niektórych testach diagnostycznych medycznych możesz szukać bardzo małej ilości określonego biomarkera w próbce krwi pacjenta. Jeśli czułość detektora nie jest wystarczająco wysoka, może przegapić biomarker, co prowadzi do wyniku fałszywie ujemnego. A jeśli hałas tła jest zbyt wysoki, może dać fałszywie pozytywny wynik, dzięki czemu wydaje się, że biomarker jest obecny, gdy nie jest.
Fotografowanie
Kolejne poważne ograniczenie jest kolejnym poważnym ograniczeniem. Gdy cząsteczka fluorescencyjna jest narażona na światło, może przejść zmianę chemiczną, która sprawia, że utracona zdolność do fluoresce. Nazywa się to fotografowaniem i może to być prawdziwy problem w wykrywaniu fluorescencji.
Im bardziej intensywne światło stosowane do podniecenia substancji fluorescencyjnej może wystąpić szybsze fotografowanie. A po wybielaniu cząsteczek nie można odzyskać sygnału fluorescencyjnego. Może to być duży problem w eksperymentach długoterminowych lub w czasie, gdy trzeba podjąć wiele pomiarów w czasie.
Załóżmy, że używasz detektora fluorescencyjnego do badania ruchu białka znakowanego fluorescencyjnie w żywej komórce. Jeśli światło z detektora powoduje zbyt szybko fotografowanie, nie będziesz w stanie śledzić białka bardzo długo. Możesz uzyskać tylko kilka migawek jego początkowej pozycji, zanim fluorescencja zniknie.
Istnieje kilka sposobów na zmniejszenie fotografowania, takich jak stosowanie niższych intensywności światła lub dodanie środków przeciw wybielaczów do próbki. Ale te rozwiązania nie zawsze są idealne, a fotografowanie może nadal ograniczać przydatność detektorów fluorescencyjnych w niektórych zastosowaniach.
Ograniczony zakres długości fali
Większość detektorów fluorescencyjnych ma ograniczony zakres długości fal, które mogą wykryć. Każda substancja fluorescencyjna ma specyficzną długość fali wzbudzenia i emisji, a jeśli detektor nie może pokryć odpowiednich długości fali, nie będzie w stanie wykryć fluorescencji.
Na przykład opracowywane są niektóre nowe barwniki fluorescencyjne z unikalnymi widmami wzbudzenia i emisji, które znajdują się poza zakresem tradycyjnych detektorów fluorescencyjnych. Jeśli pracujesz z tymi nowymi barwnikami, możesz potrzebować detektora o szerszym zakresie długości fali.
To ograniczenie może być również problemem, gdy próbujesz wykryć wiele substancji fluorescencyjnych jednocześnie. Różne substancje zwykle mają różne długości fali emisji, a jeśli detektor nie może ich pokryć wszystkich, nie będziesz w stanie zmierzyć wszystkich substancji jednocześnie.
Zakłócenia z innych substancji
Inne substancje w próbce mogą mieć wpływ na detektory fluorescencyjne. Niektóre substancje mogą ugasić fluorescencję docelowej cząsteczki. Gaszenie ma miejsce, gdy cząsteczka zmniejsza intensywność fluorescencji innej cząsteczki poprzez interakcję fizyczną lub chemiczną.
Na przykład niektóre jony metali lub inne związki chemiczne w próbce mogą wiązać się z cząsteczką fluorescencyjną i zmienić jej strukturę w sposób, który zmniejsza jej zdolność do fluoressyjnego. Może to prowadzić do niedoszacowania stężenia substancji docelowej.
W monitorowaniu środowiska, jeśli próbujesz wykryć zanieczyszczenie fluorescencyjne w próbce wody, w wodzie mogą istnieć inne substancje, które mogą ugasić fluorescencję zanieczyszczenia. Może to wydawać się, że zanieczyszczenie jest obecne w niższym stężeniu niż w rzeczywistości.
Wrażliwość na temperaturę i pH
Właściwości fluorescencji wielu substancji są wrażliwe na temperaturę i pH. Zmiana temperatury lub pH może wpływać na strukturę cząsteczki fluorescencyjnej, która z kolei może zmienić jej widma wzbudzenia i emisji, a także intensywność fluorescencji.
Jeśli temperatura lub pH próbki nie jest prawidłowo kontrolowana, może to prowadzić do niedokładnych wyników. Na przykład w próbce biologicznej pH może się różnić w zależności od zastosowanego bufora lub aktywności metabolicznej komórek. Jeśli detektor fluorescencji nie jest skalibrowany dla tych zmian, może to dać nieprawidłowe pomiary.
Załóżmy, że używasz detektora fluorescencyjnego do pomiaru pH roztworu za pomocą pH wrażliwego na barwnik fluorescencyjny. Jeśli temperatura roztworu zmienia się podczas pomiaru, może wpływać na fluorescencję barwnika, co daje niedokładne odczyt pH.
Koszt i złożoność
Detektory fluorescencyjne mogą być dość drogie, zwłaszcza modele o wysokiej jakości z zaawansowanymi funkcjami, takimi jak wysoka wrażliwość i szeroki zakres długości fali. Koszt zakupu i utrzymania tych detektorów może być główną barierą dla niektórych laboratoriów badawczych lub małych firm.
Oprócz kosztów detektory fluorescencyjne mogą być również złożone w obsłudze. Często wymagają specjalistycznego szkolenia w celu konfigurowania, kalibracji i rozwiązywania problemów. A jeśli coś pójdzie nie tak, może to być trudne i czas - konsumowanie.
Na przykładIzotermiczny detektor fluorescencjiiCyfrowy izotermiczny detektor fluorescencjisą zaawansowanymi urządzeniami, które oferują wykrywanie fluorescencji o wysokiej wydajności. Ale ich złożoność oznacza, że użytkownicy muszą dobrze zrozumieć technologię, aby jak najlepiej wykorzystać ich.
Wniosek
Pomimo tych ograniczeń detektory fluorescencyjne są nadal niezwykle cennymi narzędziami w wielu dziedzinach. W naszej firmie nieustannie pracujemy nad przezwyciężeniem tych wyzwań i poprawą wydajności naszych detektorów. Opracowujemy nowe technologie w celu zwiększenia czułości, zmniejszenia szumu w tle i minimalizacji fotografowania.
Jeśli jesteś na rynku detektora fluorescencji lub jeśli masz jakieś pytania dotyczące pracy wokół tych ograniczeń w konkretnej aplikacji, nie wahaj się dotrzeć. Jesteśmy tutaj, aby pomóc Ci znaleźć najlepsze rozwiązanie dla Twoich potrzeb. Niezależnie od tego, czy jesteś badaczem w dużym laboratorium, czy właścicielem małej firmy szukającej niezawodnego systemu wykrywania, mamy wiedzę i produkty, które Cię wspierają. Porozmawiajmy o tym, jak możemy sprawić, by wykrywanie fluorescencji działało dla Ciebie.
Odniesienia
- Lakowicz, Jr (2006). Zasady spektroskopii fluorescencyjnej. Springer Science & Business Media.
- Valeur, B. (2002). Fluorescencja molekularna: zasady i zastosowania. Wiley - VCH.