Polaryzacja fluorescencyjna (FP) jest potężną techniką stosowaną w różnych dziedzinach, w tym biochemii, farmakologii i nauk o środowisku. Jako wiodący dostawca detektora fluorescencji rozumiemy znaczenie dokładnych i wiarygodnych pomiarów FP. W tym poście na blogu zbadamy, jak mierzyć polaryzację fluorescencji, od podstawowych zasad po rozważania praktyczne.
Podstawowe zasady polaryzacji fluorescencji
Polaryzacja fluorescencyjna opiera się na fakcie, że gdy cząsteczka fluorescencyjna jest wzbudzona przez spolaryzowane światło, emitowane światło jest również spolaryzowane. Stopień polaryzacji emitowanego światła zależy od ruchu obrotowego cząsteczki fluorescencyjnej podczas życia fluorescencyjnego. Jeśli cząsteczka jest duża lub związana z makrocząsteczką, jej ruch obrotowy jest ograniczony, a emitowane światło pozostaje wysoce spolaryzowane. I odwrotnie, jeśli cząsteczka jest niewielka i wolna w roztworze, jej ruch obrotowy jest szybki, a emitowane światło staje się depolaryzowane.
Polaryzacja fluorescencji jest określana ilościowo przez wartość polaryzacji (P), która jest zdefiniowana jako różnica między intensywnością pionowo i poziomo spolaryzowanych składników światła emitowanego podzielonego przez ich sumę:
[P = \ frac {i _ {\ paralle} -i _ {\ perp}} {i _ {\ paralle}+i _ {\ Pul.}}]
gdzie (i _ {\ paralle}) jest intensywnością pionowo spolaryzowanego światła emitowanego i (i _ {\ perp}) jest intensywnością poziomego spolaryzowanego światła emitowanego.
Oprzyrządowanie do pomiaru polaryzacji fluorescencji
Aby zmierzyć polaryzację fluorescencji, potrzebujesz detektora fluorescencji wyposażonego w optykę polaryzacyjną. Nasza firma oferuje szereg wysokiej jakości detektorów fluorescencyjnych, w tymIzotermiczny detektor fluorescencjiiCyfrowy izotermiczny detektor fluorescencji, które są specjalnie zaprojektowane do dokładnych i wrażliwych pomiarów FP.
Te detektory zazwyczaj składają się z następujących elementów:
- Źródło światła: Źródło światła, takie jak lampa ksenonowa lub laser, służy do generowania światła wzbudzenia. Światło powinno być spolaryzowane, zanim dotrze do próbki.
- Polaryzatorzy: Polaryzatory są używane do kontrolowania polaryzacji światła wzbudzenia i emisji. Polaryzator wzbudzenia jest umieszczany na ścieżce światła wzbudzenia, aby upewnić się, że jest on liniowo spolaryzowany. Polaryzator emisji jest umieszczony przed detektorem w celu pomiaru pionowo i poziomo spolaryzowanych komponentów emitowanego światła.
- Przykładowy uchwyt: Uchwyt próbki służy do trzymania próbki na ścieżce światła wzbudzenia. Powinien być zaprojektowany w celu zminimalizowania rozpraszania światła i fluorescencji tła.
- Detektor: Fotodetektor, taki jak rurka fotomultiplora (PMT) lub urządzenie sprzężone z ładunkiem (CCD), służy do pomiaru intensywności emitowanego światła. Detektor powinien być w stanie zmierzyć intensywności komponentów spolaryzowanych pionowo i poziomo osobno.
Eksperymentalna konfiguracja pomiarów polaryzacji fluorescencji
Poniższe kroki są zaangażowane w nawiązanie eksperymentu w celu pomiaru polaryzacji fluorescencji:
- Wybierz odpowiednią sondę fluorescencyjną: Wybierz sondę fluorescencyjną odpowiednią do aplikacji. Sonda powinna mieć wysoką wydajność kwantową i długi okres fluorescencji.
- Przygotuj próbkę: Przygotuj próbkę, rozpuszczając sondę fluorescencyjną w odpowiednim buforze. Jeśli badasz interakcję wiążącą, dodaj ligand lub makrocząsteczkę do próbki w odpowiednim stężeniu.
- Kalibruj instrument: Kalibruj detektor fluorescencji zgodnie z instrukcjami producenta. Może to obejmować dostosowanie wzmocnienia detektora, ustawienie długości fali wzbudzenia i emisji oraz pomiar fluorescencji tła.
- Zmierz wartości polaryzacji: Umieść próbkę w uchwycie próbki i zmierz intensywność pionowo i poziomo spolaryzowanych składników emitowanego światła. Oblicz wartość polaryzacji za pomocą wzoru wspomnianego powyżej.
Czynniki wpływające na pomiary polaryzacji fluorescencji
Kilka czynników może wpływać na dokładność i niezawodność pomiarów polaryzacji fluorescencji:
- Temperatura: Ruch obrotowy cząsteczki fluorescencyjnej zależy od temperatury. Wzrost temperatury prowadzi do wzrostu ruchu obrotowego i spadku wartości polaryzacji. Dlatego ważne jest utrzymanie stałej temperatury podczas pomiaru.
- Lepkość rozpuszczalnika: Lepkość rozpuszczalnika wpływa na ruch obrotowy cząsteczki fluorescencyjnej. Bardziej lepki rozpuszczalnik ogranicza ruch obrotowy i zwiększa wartość polaryzacji.
- Stężenie sondy fluorescencyjnej: Stężenie sondy fluorescencyjnej może wpływać na wartość polaryzacji. Przy wysokich stężeniach może wystąpić samoleczenie i agregacja sondy, co prowadzi do niedokładnych pomiarów.
- Fotografowanie: Fotografowanie to nieodwracalne zniszczenie cząsteczki fluorescencyjnej przez światło wzbudzenia. Może to prowadzić do zmniejszenia intensywności fluorescencji i wpływać na pomiar polaryzacji. Aby zminimalizować fotografowanie, użyj światła wzbudzenia o niskiej intensywności i krótkich czasach ekspozycji.
Zastosowania polaryzacji fluorescencji
Polaryzacja fluorescencyjna ma szeroki zakres zastosowań w różnych dziedzinach:
- Odkrycie narkotyków: FP służy do badania interakcji wiążących między lekami i ich celami. Mierząc wartość polaryzacji, możesz określić powinowactwo wiązania i stałą dysocjacji kompleksu docelowego leku.
- Testy immunologiczne: Immunologiczne testy oparte na FP są wykorzystywane do wykrywania obecności antygenów lub przeciwciał w próbkach biologicznych. Wiązanie antygenu z fluorescencyjną sondę znakowaną przeciwciałem prowadzi do zmiany wartości polaryzacji, którą można wykorzystać do kwantyfikacji analitu.
- Analiza kwasu nukleinowego: FP można wykorzystać do badania hybrydyzacji kwasów nukleinowych. Wiązanie oligonukleotydu znakowanego fluorescencyjnie z jego komplementarną sekwencją prowadzi do zmiany wartości polaryzacji, którą można wykorzystać do wykrywania i ilościowego kwantyfikacji docelowego kwasu nukleinowego.
Rozwiązywanie problemów z pomiarami polaryzacji fluorescencji
Jeśli napotkasz problemy podczas pomiarów polaryzacji fluorescencji, pomocne mogą być następujące wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów:
- Niskie wartości polaryzacji: Jeśli wartości polaryzacji są niższe niż oczekiwano, sprawdź takie czynniki, jak wysoka temperatura, niska lepkość rozpuszczalnika lub wysokie stężenie sondy fluorescencyjnej.
- Fluorescencja wysokiego tła: Fluorescencja wysokiego tła może być spowodowana zanieczyszczeniami w próbce lub rozpuszczalniku lub rozpraszaniem światła. Oczyszcz próbkę i użyj czystego rozpuszczalnika. Upewnij się, że uchwyt próbki jest czysty i wolny od zarysowań.
- Niespójne pomiary: Niespójne pomiary mogą być spowodowane fotografowaniem, złym wyrównaniem polaryzatorów lub fluktuacji w źródle światła. Minimalizuj fotografowanie, sprawdź wyrównanie polaryzatorów i upewnij się, że źródło światła jest stabilne.
Wniosek
Pomiar polaryzacji fluorescencji jest cenną techniką badania interakcji wiążących i dynamiki molekularnej cząsteczek fluorescencyjnych. Jako dostawca detektora fluorescencji jesteśmy zaangażowani w zapewnienie oprzyrządowania o wysokiej jakości i wsparciu technicznym, aby pomóc Ci osiągnąć dokładne i niezawodne pomiary FP. Niezależnie od tego, czy pracujesz w odkrywaniu leków, testach immunologicznych, czy analizie kwasu nukleinowego, naszIzotermiczny detektor fluorescencjiICyfrowy izotermiczny detektor fluorescencjimoże zaspokoić Twoje potrzeby.
Jeśli jesteś zainteresowany zakupem naszych detektorów fluorescencyjnych lub masz pytania dotyczące pomiarów polaryzacji fluorescencji, skontaktuj się z nami w celu szczegółowych negocjacji w zakresie konsultacji i zamówień. Nasz zespół ekspertów jest gotowy pomóc w wyborze najbardziej odpowiedniego instrumentu do aplikacji.
Odniesienia
- Lakowicz, Jr (2006). Zasady spektroskopii fluorescencyjnej. Springer Science & Business Media.
- Szollosi, J., i Damjanovich, S. (2004). Polaryzacja fluorescencyjna: praktyczny przewodnik. W obecnych protokole w cytometrii (str. 1–17). John Wiley & Sons, Inc.