System CRISPR - CAS zrewolucjonizował dziedzinę edycji genów ze względu na jego prostotę, wysoką swoistość i wydajność. Jednak, podobnie jak każda technologia, nie jest to pozbawione ograniczeń. Jednym z wyzwań w stosowaniu CRISPR - CAS jest osiąganie edycji genów o wysokiej wydajności, szczególnie w złożonych genomach i niektórych typach komórek. Rekombinazy, enzymy katalizujące rekombinację genetyczną, bardzo obiecują zwiększyć wydajność systemów CRISPR - CAS. Jako dostawca rekombinazy, cieszę się, że mogę zbadać, w jaki sposób te potężne enzymy można zintegrować z CRISPR - CAS, aby odblokować nowe możliwości edycji genów.
Zrozumienie systemu CRISPR - CAS
System CRISPR - CAS jest naturalnym mechanizmem obronnym w bakteriach i archaea przeciwko inwazji na wirusy i plazmidy. Składa się z prowadzenia RNA (GRNA), który jest ukierunkowany na specyficzną sekwencję DNA i nukleazę CAS, która rozszczepia DNA w ukierunkowanym miejscu. Po odszczepie DNA wchodzą naturalne mechanizmy naprawy komórki. Istnieją dwa główne ścieżki naprawy: nie -homologiczny koniec - łączenie (NHEJ) i homologia - reżyserka (HDR). NHEJ jest błędem - podatnym i często prowadzi do niewielkich wstawek lub delecji (indels), podczas gdy HDR można użyć do wprowadzenia precyzyjnych zmian genetycznych, gdy podano szablon DNA dawcy.
Wydajność edycji genów za pośrednictwem CRISPR - zależy od kilku czynników, w tym od dostarczania nukleazy CAS i GRNA do komórek docelowych, aktywności nukleazy CAS w miejscu docelowym oraz wydajności szlaków naprawy DNA. W wielu przypadkach niska wydajność HDR jest głównym wąskim gardłem, szczególnie w komórkach pierwotnych i zastosowaniach in vivo.
W jaki sposób rekombinazy mogą zwiększyć wydajność CRISPR - CAS
1. Ułatwianie homologii - Reżyseria naprawa (HDR)
Rekombinazy mogą odgrywać kluczową rolę w promowaniu HDR. Jednym z kluczowych kroków w HDR jest inwazja szablonu DNA dawcy w odciętym DNA w miejscu docelowym. Rekombinazy, takie jak RECA w bakteriach, mogą tworzyć włókno nukleoproteinowe na DNA dawcy. Ten żarnik może następnie wyszukiwać homologiczne sekwencje w odszczepionym DNA i promować inwazję nici, co jest kluczowym krokiem w HDR.
Na przykład przez CO - dostarczanie rekombinazy z systemem CRISPR - CAS i szablon DNA dawcy, możemy zwiększyć prawdopodobieństwo udanych zdarzeń HDR. Wykazano, że takie podejście znacznie poprawia wydajność precyzyjnej edycji genów w różnych typach komórek. Rekombinaza pomaga przezwyciężyć bariery kinetyczne związane z HDR, co zwiększa prawdopodobieństwo, że komórka użyła szablonu DNA dawcy do naprawy zamiast uciekać się do szlaku podatnego na błąd.
2. Poprawa specyficzności ukierunkowania
Oprócz promowania HDR rekombinazy mogą również zwiększyć specyficzność ukierunkowania systemu CRISPR - CAS. Niektóre rekombinazy mają zdolność rozpoznawania i wiązania się ze specyficznymi sekwencjami DNA o wysokim powinowactwie. Inżynierię rekombinazy do interakcji z kompleksem CRISPR - CAS, możemy zwiększyć swoistość nukleazy CAS dla miejsca docelowego.
Można to osiągnąć poprzez połączenie rekombinazy z nukleazą CA lub za pomocą systemu celowania opartego na rekombinazie w połączeniu z CRISPR - CAS. Rekombinaza może pomóc w poprowadzeniu nukleazy CAS do odpowiedniego miejsca docelowego, zmniejszając efekty docelowe. OFF - Efekty docelowe stanowią poważny problem w zastosowaniach CRISPR - CAS, ponieważ mogą prowadzić do niezamierzonych zmian genetycznych i potencjalnych problemów bezpieczeństwa. Poprawiając specyficzność ukierunkowaną, rekombinazy mogą sprawić, że system CRISPR - CAS jest bardziej niezawodny i bezpieczny do stosowania w terapii genowej i innych zastosowaniach.
3. Pokonanie barier chromatynowych
Struktura chromatyny może stanowić znaczącą barierę dla dostępu do systemu CRISPR - CAS do docelowego DNA. DNA w komórkach eukariotycznych jest ściśle pakowane z białkami histonowymi z tworzeniem chromatyny, które mogą ograniczyć wiązanie nukleazy Cas i GRNA do miejsca docelowego. Recombinazy mogą pomóc w przezwyciężeniu tych barier chromatyny.
Niektóre rekombinazy mają zdolność oddziaływania z białkami związanymi z chromatyną i modyfikowania struktury chromatyny w pobliżu miejsca docelowego. Może to sprawić, że docelowe DNA jest bardziej dostępne dla systemu CRISPR - CAS, zwiększając wydajność edycji genów. Na przykład, stosując rekombinazę, która może przebudować chromatynę, możemy zwiększyć wiązanie nukleazy Cas i GRNA z miejscem docelowym, co prowadzi do bardziej wydajnego rozszczepienia DNA i późniejszej naprawy.
Nasze produkty rekombinazy i ich potencjał w zakresie poprawy CRISPR - CAS
Jako dostawca rekombinazy oferujemy szereg wysokiej jakości produktów rekombinazy, które nadają się do zwiększenia wydajności systemów CRISPR - CAS. Nasze rekombinazy są starannie oczyszczane i scharakteryzowane w celu zapewnienia optymalnej wydajności w aplikacjach edycji genów.
Oprócz naszych produktów rekombinazy oferujemy również inne enzymy, które można stosować w połączeniu z CRISPR - CAS i rekombinazami w celu dalszego zwiększenia wydajności edycji genów. Na przykład,Egzonukleaza III 2.0Może być używany do przetwarzania końców szablonu DNA dawcy, co czyni go bardziej odpowiednim dla HDR.M - MLV H - 2.0Może być stosowany do odwrotnej transkrypcji, co może być przydatne w niektórych strategiach edycji genów. IPolimeraza DNA 2.0Może być używany do syntezy szablonu DNA dawcy lub do wypełnienia luk podczas procesu naprawy.
Studia przypadków i zastosowania
Nastąpiło kilka udanych studiów przypadków wykazujących stosowanie rekombinaz w celu zwiększenia wydajności CRISPR - CAS. W jednym badaniu naukowcy zastosowali system CRISPR - CAS wspomagany rekombinazą w celu skorygowania mutacji genetycznej w pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka (IPSC). Przez CO - dostarczanie rekombinazy z komponentami CRISPR - CAS i szablonem DNA dawcy, były one w stanie osiągnąć znacznie wyższą wydajność HDR w porównaniu z samym systemem CRISPR - CAS. Takie podejście ma potencjalne zastosowania w terapii genowej chorób genetycznych, ponieważ pozwala na precyzyjną korekcję mutacji choroby.
W innym przypadku zastosowano rekombinazy w celu poprawy specyficzności ukierunkowania systemu CRISPR - CAS w roślinach. Dzięki inżynierii systemu celowania opartego na rekombinazie naukowcy byli w stanie zmniejszyć efekty docelowe i zwiększyć wydajność edycji genów w roślinach uprawnych. Ma to implikacje dla biotechnologii rolnej, ponieważ można ją wykorzystać do rozwijania upraw o ulepszonych cech, takich jak odporność na choroby i zwiększona wydajność.
Wniosek i wezwanie do działania
Rekombinazy mają duży potencjał w zwiększeniu wydajności systemów CRISPR - CAS. Promując HDR, poprawiając specyficzność celowania i przezwyciężając bariery chromatyny, rekombinazy mogą rozwiązać niektóre z kluczowych ograniczeń technologii CRISPR - CAS. Jako dostawca rekombinazy jesteśmy zaangażowani w zapewnianie produktów wysokiej jakości i wsparcie techniczne dla badaczy i firm biotechnologicznych pracujących w dziedzinie edycji genów.
Jeśli chcesz zbadać wykorzystanie rekombinaz w celu poprawy aplikacji CRISPR - CAS, zapraszamy do skontaktowania się z nami w celu uzyskania więcej informacji. Nasz zespół ekspertów może pomóc Ci wybrać odpowiednie produkty rekombinazy i zapewnić wskazówki dotyczące projektowania eksperymentalnego. Z niecierpliwością czekamy na współpracę z Tobą, aby rozwinąć dziedzinę edycji genów i wprowadzić nowe rozwiązania do stołu.
Odniesienia
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, Ja, i Charpentier, E. (2012). Programowalna podwójna endonukleaza DNA z podwójnym RNA w adaptacyjnej odporności bakteryjnej. Science, 337 (6096), 816 - 821.
- Mali, P., Yang, L., Esvelt, KM, Aach, J., Guell, M., DiCarlo, JE, ... & Church, GM (2013). RNA - z przewodnikiem inżynierii genomu ludzkiego przez CAS9 Science, 339 (6121), 823 -
- Li, X., Yang, Y., i Zhang, Y. (2016). Recombineering: homologiczna metoda inżynierii genetycznej opartą na rekombinacji. Protokoły przyrody, 11 (3), 476 - 492.
- Pinder, JC i Cheng, AW (2019). Poprawa edycji genów CRISPR - CAS9 za pomocą rekombinazy ukierunkowania DNA. Metody w biologii molekularnej, 1970, 273–285.