Hej! Jako dostawca zestawów amplifikacji izotermicznej RNA często zadawano mi to pytanie: „Czy zestaw amplifikacji izotermicznej RNA można wykorzystać do analizy ilościowej RNA?” Cóż, zanurzmy się w to i rozbijmy.
Po pierwsze, co jest wzmocnienie izotermiczne RNA? W przeciwieństwie do bardziej znanej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która wymaga wielu cykli temperatury, amplifikacja izotermiczna RNA odbywa się w stałej temperaturze. To dość sprytna technologia, która zyskuje na popularności w ostatnich latach.
Jedną z głównych zalet zastosowania zestawu amplifikacji izotermicznej RNA jest jego prostota. Nie potrzebujesz fantazyjnego termocyklera z tymi wszystkimi ustawieniami zmieniającymi temperaturę. To sprawia, że jest bardziej dostępny, szczególnie w przypadku testowania opieki lub w zasobach - ograniczone ustawienia. Ale pozostaje najważniejsze pytanie: czy można je wykorzystać do analizy ilościowej?
Zacznijmy od spojrzenia na podstawowe zasady analizy ilościowej RNA. Krótko mówiąc, chcemy dokładnie wiedzieć, ile określonej cząsteczki RNA jest obecna w próbce. Ma to kluczowe znaczenie w wielu dziedzinach, takich jak wirusologia do pomiaru obciążenia wirusowego lub w badaniach ekspresji genów, aby zrozumieć, w jaki sposób geny są regulowane.
Tradycyjne metody ilościowej analizy RNA, takie jak PCR (QPCR), były złotym standardem. QPCR wykorzystuje barwniki lub sondy fluorescencyjne do wykrycia ilości amplifikowanego DNA (który jest odwrotny - transkrybowany z RNA) w czasie rzeczywistym. Cykl, w którym fluorescencja przekracza określony próg (wartość CT), jest następnie stosowany do obliczenia początkowej ilości RNA w próbce.
Teraz dla zestawów amplifikacji izotermicznej RNA. Zestawy te zazwyczaj działają przy użyciu enzymów, które mogą wzmacniać RNA w stałej temperaturze. Na przykładMIRA RNA izotermiczny zestaw szybkiego wzmocnieniajest jednym z naszych produktów, które wykorzystują tę technologię. Może szybko wzmacniać cele RNA, ale czy możemy go użyć do ich ilościowego kwantyfikacji?
Odpowiedź jest nieco bardziej skomplikowana niż proste tak lub nie. Z jednej strony istnieją pewne wyzwania. W przeciwieństwie do QPCR, który ma dobrze ustaloną metodę kwantyfikacji opartej na wartości CT, wzmocnienie izotermiczne RNA nie ma bezpośredniego odpowiednika. Kinetyka amplifikacji w układach izotermicznych może być bardziej złożona, a czynniki takie jak początkowe warunki reakcji, aktywność enzymu i dostępność substratu mogą mieć większy wpływ na szybkość wzmocnienia.
Nie oznacza to jednak, że jest to niemożliwe. Niektórzy badacze wymyślili kreatywne sposoby uczynienia wzmocnienia izotermicznego RNA odpowiednie do analizy ilościowej. Jednym podejściem jest stosowanie standardów wewnętrznych. Podobnie jak w QPCR, możesz dodać do swojej próbki znaną ilość kontrolnej cząsteczki RNA. Porównując amplifikację docelowego RNA z amplitem kontrolnym RNA, możesz uzyskać oszacowanie ilości docelowego RNA.
Innym sposobem jest zastosowanie metod wykrywania opartych na fluorescencji w połączeniu z amplifikacją izotermiczną RNA. Na przykład niektóre z naszych zestawów, takie jakMIRA RNA izotermiczny zestaw szybkiego amplifikacji pasek testowy kwasu nukleinowego, można zmodyfikować w celu włączenia sond fluorescencyjnych. Mierząc intensywność fluorescencji w czasie, możesz monitorować proces amplifikacji i potencjalnie używać go do oceny ilościowej.
Porozmawiajmy również o zaletach korzystania z naszych zestawów amplifikacji izotermicznej RNA do analizy ilościowej w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Jak wspomniałem wcześniej, prostota i prędkość są ogromnymi plusami. Dzięki naszym zestawom możesz uzyskać wyniki w znacznie krótszym czasie w porównaniu do QPCR, co zwykle zajmuje godzinę lub dłużej. Jest to szczególnie ważne w sytuacjach, w których szybka diagnoza ma kluczowe znaczenie, podobnie jak podczas wybuchu choroby zakaźnej.
Ponadto nasze zestawy są wysoce specyficzne. Są one zaprojektowane tak, aby ukierunkowały tylko interesujące sekwencje RNA, zmniejszając szanse na fałszywe - pozytywne wyniki. Ta specyficzność jest niezbędna do dokładnej analizy ilościowej, ponieważ chcesz upewnić się, że mierzysz tylko RNA, którym jesteś zainteresowany.
Poruszajmy teraz niektóre z praktycznych aspektów. Jeśli rozważasz użycie naszych zestawów izotermicznych RNA do analizy ilościowej, należy pamiętać o kilku rzeczach. Po pierwsze, musisz zoptymalizować warunki reakcji. Obejmuje to takie rzeczy, jak koncentracja enzymów, starterów i innych odczynników. Dobrze zoptymalizowana reakcja da ci bardziej powtarzalne wyniki, co jest kluczowe dla dokładnej ilościowej.
Po drugie, musisz potwierdzić swoją metodę ilościową. Oznacza to uruchomienie wielu powtórzeń znanych próbek i porównanie wyników z metodą odniesienia, taką jak QPCR. W ten sposób możesz ustalić dokładność i precyzję analizy ilościowej przy użyciu naszych zestawów amplifikacji izotermicznej RNA.
Mamy też kolejny świetny produkt,MIRA DNA izotermiczny zestaw szybkiego wzmocnienia. Chociaż dotyczy to wzmocnienia DNA, zasady analizy ilościowej mogą być pod pewnymi względami podobne. W niektórych przypadkach można go stosować w połączeniu z analizą RNA, na przykład, gdy chcesz zbadać związek między poziomami DNA i RNA w komórce.
Podsumowując, podczas gdy zestawy amplifikacji izotermicznej RNA stoją przed pewnymi wyzwaniami, jeśli chodzi o analizę ilościową RNA, jest to możliwe przy właściwym podejściu. Nasza firma jest zaangażowana w dostarczanie zestawów wysokiej jakości i wspieranie naszych klientów w badaniu potencjału tych technologii do zastosowań ilościowych.
Jeśli chcesz dowiedzieć się więcej o naszych zestawach do wzmocnienia izotermicznego RNA lub chcesz omówić, w jaki sposób można je wykorzystać do twoich potrzeb analizy ilościowej, chcielibyśmy usłyszeć od Ciebie. Po prostu skontaktuj się z nami, aby rozpocząć rozmowę na temat zamówień i tego, jak możemy współpracować, aby osiągnąć twoje cele badawcze.
Odniesienia
- Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N. i Hase, T. (2000). Izotermiczna amplifikacja DNA za pośrednictwem pętli. Badanie kwasów nukleinowych, 28 (12), E63 - E63.
- Gootenberg, JS, Abudayyeh, OO, Lee, JW, Essletzbichler, P., Dy, A., Joung, J., ... i Zhang, F. (2018). Wykrywanie kwasu nukleinowego za pomocą CRISPR - CAS13A/C2C2. Science, 360 (6387), 439 - 444.